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神谷薫 劇場版（武井咲）
四乃森蒼紫（しのもり あおし）
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江戸城において警護を務めた御庭番衆最後の御頭で、15歳にしてその座を継いだ天才。大政奉還の後、明治政府は御庭番衆の中で彼だけに要職を用意していたが、路頭に迷う部下のためにそれを蹴り、戦いを求めて彷徨っていた。
『東京編』で初登場。この時は武田観柳の用心棒であり、幕末最強と謳われた人斬り抜刀斎を倒して御庭番衆こそが最強であることを示そうとするが、剣心の前に敗北。加えて観柳に裏切られ部下を失ってしまい、以後、死んだ部下の墓前に最強の二文字を添えるために修羅と化す。
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四乃森蒼紫 劇場実写版（伊勢谷友介）
斎藤一（さいとう はじめ）
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元・新選組三番隊組長で、維新後は明治政府の警官（警部補）。
新撰組でも屈指の剣腕の持ち主で、幕末時代からの剣心の宿敵。世を蝕む悪を即座に絶つ「悪・即・斬（あく・そく・ざん）」の正義を自身の信念とする。幕末の動乱・戊辰戦争・西南戦争を戦い抜き、明治時代における新撰組の数少ない生き残りとなる。維新後は「藤田五郎」と名を改め、明治に生きる新撰組として「悪・即・斬」を貫くために警視庁に奉職。警官として勤務する裏で、政府の密偵として暗躍する。
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斎藤一 劇場実写版（江口洋介）
高荷恵（たかに めぐみ）
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会津出身の美人女医。脱藩してまで西洋医学に心血を注ぎ、会津戦争の最中に行方不明となった父親の消息を探るため上京するが、悪徳実業家の武田観柳にその才能を悪用され、観柳の監禁の下で阿片を作らされる羽目になる。剣心と出会って命を助けられた後は、戦いで傷付いた人々の治療を行う役目を担う。料理は得意で、薫の料理に文句を言わない弥彦でさえも「恵が料理を作る」という理由で神谷道場宿泊を許可している。
気丈な性格で、高飛車かつ蓮っ葉な物言いで言語の訛りを隠している。
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高荷恵 劇場実写版（蒼井優）
巻町操（まきまち みさお）
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蒼紫に恋する、男勝りで感情豊か、かつ我が儘な一面を持つ少女。御庭番衆先代御頭（蒼紫の師匠）の孫娘。東海道で京都に向かっていた剣心に会い、京都まで同行する。その時は路銀をなくして追剥をしていた。御庭番式苦無術と、般若譲りの御庭番式拳法を使いこなし、常人レベルを超えた実力を誇る。ただし、剣心達と比較すると実力は大幅に落ちるため、戦力として扱われていない。蒼紫の部下（御庭番衆）にも懐いていた。
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